Effects of polyvitamin deficiency on the activity of xenobiotic-metabolizing enzymes in rat liver

AbstractThe activity of xenobiotic-metabolizing enzymes was studied in the liver of male Wistar rats, which were fed for 4 weeks diets, containing 100 (control), 50 and 20% of vitamin adequate level. Moderate (50%) polyvitamin deficiency increased activity of EROD (by 13%), MROD (by 34%; p<0,05), 4-nitrophenol hydroxylase (by 16%), 6β-testosterone hydroxylase (by 17%), UDP-glucuronosyle transferase (by 26%, p<0,05) and quinone reductase (by 55%, p<0,05). Deep (20%) polyvitamin deficiency decreased in liver activity of MROD (to 78% of control level, p<0,05), 4-nitrophenol hydroxylase (to 74%, p<0,05), heme oxygenase-1 (to 83%, p<0,05) and quinone reductase (to 60%, p<0,05). At the same time a 22% increase in the UDP-glucuronosyle transferase activity compared to the control group was found; activities of EROD, PROD, 6β-testosterone hydroxylase and the total activity of glutathione S-transferase were unchanged. Deep polyvitamin deficiency had no significant effect on CYP1A1 mRNA and AhR mRNA level, whereas the expression of CYP1A2 mRNA and CYP3A1 mRNA were decreased to 62 and 79%, respectively, as compared with control.

Keywords:xenobiotic-metabolizing enzymes, xenobiotic-metabolizing enzymes gene expression, polyvitamin deficiency

Вопр. питания. - 2012. - № 2. - С. 28-33.

Ферменты метаболизма ксенобиотиков (ФМК) представляют основную линию защиты клетки от повреждающего действия многочисленных токсических факторов окружающей среды и окислительного стресса, что определяет актуальность изучения механизмов регуляции их активности.

ФМК I фазы включают суперсемейство цитохромов Р450, среди которых наиболее изучены цитохромы подсемейства 1А (CYP1A1 и CYP1A2) - их основная функция - биотрансформация ксенобиотиков и небольшого числа лекарственных средств, а также цитохромы подсемейства CYP3A, отвечающие за метаболизм более чем 50% используемых лекарственных средств. ФМК II фазы (ключевые среди них - UDP-глюкуронозилтрансферазы (UGT) и глутатионтрансферазы) обеспечивают инактивацию и выведение продуктов окисления эндогенных и чужеродных соединений. Большинство из них обладают и антиоксидантной активностью - глутатионтрансферазы, хинонредуктаза, гемоксигеназа-1.

Накапливаются экспериментальные данные, позволяющие рассматривать витамины (преимущественно жирорастворимые) как важный алиментарный фактор, участвующий в регуляции активности ФМК. Так, дефицит витамина Е в рационе приводит к уменьшению общего содержания цитохрома Р450 и снижению пентоксирезоруфиндеалкилазной (ПРОД) активности CYP2B1/2 и активности глутатионтрансферазы в печени крыс [9]. Дополнительное включение в рацион витамина Е стимулирует экспрессию генов CYP2B и CYP3A у крыс [19] и Cyp3a11 и глутатионтрансферазы - у мышей [18].

Недостаточность витамина А в эксперименте на крысах оказывала существенное влияние на активность ФМК и баланс между активностью ферментов I и II фазы [12, 15]. При длительном (в течение 10 нед) дефиците витамина А в печени крыс уменьшалось общее содержание цитохрома Р450 и снижалась активность CYP1A1, CYP2B1 и UDP-глюкуронозилтрансферазы, но возрастала активность глутатионтрансферазы. С использованием различных подходов было убедительно доказано [23], что ретиноиды индуцируют активность и экспрессию мРНК CYP3A в клетках печени и тонкой кишки.

Есть основания полагать, что влияние витаминов Е и А на активность ФМК связано с их участием в регуляции рецептор-опосредованных сигнальных путей.

В экспериментах на клеточных культурах установлено, что витамины Е и А способны активировать транскрипционные факторы PXR (прегнановый Х-рецептор) и CAR (конститутивный андростановый рецептор), регулирующие экспрессию генов CYP3A, CYP2B1 и ряда изоформ UGT и глутатионтрансферазы [10, 21]. Особого внимания заслуживают данные о способности витамина Е индуцировать in vitro экспрессию гена фактора Nrf2, главного регулятора активности большинства антиоксидантных ферментов и ФМК II фазы на транскрипционном уровне [11, 14].

Согласно данным [2], недостаток витаминов группы В у взрослого населения РФ в последние годы встречается значительно чаще, чем других витаминов. В эксперименте дефицит витамина В1 приводил к парадоксальной реакции ФМК - в печени крыс обнаруживали возрастание активности CYP2E1 (анилингидроксилазы), CYP3A (этилморфин-N-деметилазы) и глутатионтрансферазы [22, 24]. В то же время, согласно более ранним сообщениям [4], недостаточность витамина В1 вызывала у крыс уменьшение общего содержания цитохрома Р450 в печени и снижение скорости гидроксилирования аминопирина (CYP2B1/2), этилморфина (CYP3A) и анилина (CYP2E1).

Результаты мониторинга обеспеченности витаминами населения РФ за период с 1987 по 2009 г. показали, что имеющаяся недостаточность витаминов носит характер полигиповитаминоза [2]. С учетом сказанного целью настоящей работы было изучение влияния поливитаминной недостаточности на активность ФМК в печени крыс. Работа проводилась совместно с лабораторией витаминов и минеральных веществ ФГБУ "НИИ питания" РАМН (заведующая лабораторией - доктор биологических наук В.М. Коденцова).

Материал и методы

Исследования проводили на 3 группах крыс самцов Вистар (по 8-9 животных в каждой) с исходной массой тела 70-80 г. Животные получали полусинтетический рацион, содержащий 20% казеина, 66,4% кукурузного крахмала, 9% жира (подсолнечное масло + лярд, 1:1), 3,5% солевой смеси. В рацион крыс контрольной группы добавляли 0,1% смеси водорастворимых витаминов и викасола, 0,9% смеси жирорастворимых витаминов (D,L-α-токоферола ацетата, холекальциферола и пальмитата ретинола) в подсолнечном масле [1]. Дефицит витаминов у крыс опытных групп вызывали уменьшением в 2 или 5 раз количества добавляемых в корм витаминных смесей. Животным 1-й опытной группы в корм добавляли смесь витаминов в количестве 50% от их уровня в рационе контрольной группы, животным 2-й опытной группы - 20% от контроля. Корм крысы получали ad libitum - в среднем 16,5 г сухой смеси в сут [1]. Длительность эксперимента составила 4 нед. Наблюдение за состоянием животных и поедаемостью корма проводили ежедневно, массу тела определяли еженедельно.

За 20 ч до окончания эксперимента крыс лишали корма. В микросомах, выделенных из печени, определяли активность ФМК I фазы - этоксирезоруфиндеалкилазную (ЭРОД) активность CYP1A1, метоксирезоруфиндеалкилазную (МРОД) активность CYP1A2, пентоксирезоруфиндеалкилазную (ПРОД) активность CYP2B1/2, 4-нитрофенолгидроксилазную активность CYP2E1 и 6β-тестостеронгидроксилазную (6β-ТГ) активность CYP3A [8, 20]. Кроме того, определяли активность ключевых ферментов II фазы: в микросомах - UDP-глюкуронозилтрансферазы с п-нитрофенилом в качестве субстрата-маркера UGT1А6 [7] и гемоксигеназы-1 [16], в цитозоле - общую активность глутатионтрансферазы с субстратом 1-хлор2,4-динитробензолом [13] и хинонредуктазы [5].

Экспрессию мРНК CYP1A1, CYP1A2, CYP3A и транскрипционного фактора AhR оценивали методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для выделения мРНК использовали TRI-реагент ("Sigma", США) согласно протоколу, рекомендуемому фирмойпроизводителем. Концентрацию тотальной РНК определяли, измеряя оптическую плотность при длине волны 260 нм. Для получения кДНК проводили реакцию ОТ с синтетическими гексануклеотидами, для чего использовали 4 мкг тотальной РНК. Реакцию проводили при 37 °С в течение 1 ч, выдерживали 10 с при 94 °С для инактивации фермента. Полученную кДНК использовали для ПЦР. В реакции ОТ в качестве контроля использовали воду вместо РНК. Реакцию ПЦР для всех изучаемых генов проводили по следующей схеме: денатурация при 94 °С в течение 1 мин; отжиг праймеров при 60 °С, 10 с (60 °С, 30 с для гена CYP1A2, 62 °С, 10 с для гена CYP1A1); синтез продукта при 72 °С, 10 с; выдержка - 3 мин после прохождения циклов при 72 °С. Количество циклов варьировали в пределах 22-30 в зависимости от изучаемого гена. В качестве контроля использовали РНК вместо кДНК. В ОТ-ПЦР использовали следующие ферменты: обратную транскриптазу, M-MuLV и Taq-SE-ДНК-полимеразу ("Сибэнзим", Россия). Гексануклеотиды и праймеры были синтезированы фирмой "Литех" (Россия). Реакцию ОТ и реакции амплификации проводили на приборе "Терцик" (Россия). Последовательности используемых праймеров и размеры образующихся амплифицированных фрагментов указаны в таб. 1.

Продукты ОТ-ПЦР разделяли стандартным электрофоретическим методом при напряжении 180 В в 2,5% агарозном геле, электрофореграммы денсиметрировали. При анализе гелей использовали программу Quantity One, версия 4.5.

Для определения влияния дефицита витаминов на резистентность к ПОЛ микросом печени ex vivo в выделенных микросомах определяли скорость индуцированного NADPH-Fe2+ ПОЛ [3].

Антиоксидантный статус крыс оценивали по общей антиоксидантной активности (АОА) плазмы крови и фракции цитозоля печени, используя тестсистему FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) [6].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0,05.

Таблица 1. Используемые праймеры и размеры образующихся амплифицированных фрагментов

Результаты и обсуждение

Содержание крыс в течение 4 нед на рационе с пониженным на 50% содержанием витаминов приводило к развитию у них умеренного дефицита витаминов, при котором не обнаруживали изменений уровня витаминов в плазме крови, и отмечалась тенденция к снижению их содержания в печени [1]. Как видно из данных, представленных в табл. 2 и 3, в печени крыс с умеренным дефицитом витаминов (1-я опытная группа) активность ряда ФМК умеренно возрастала (по сравнению с контролем): ЭРОД - на 13%, МРОД - на 34% (р<0,05), 4-нитрофенолгидроксилазы - на 16%, 6β-ТГ - на 17%, UDP-глюкуронозилтрансферазы - на 26% (р<0,05), активность хинонредуктазы - на 55% (р<0,05). В этих условиях активность ПРОД, глутатионтрансферазы и гемоксигеназы-1 не отличалась от уровня в контрольной группе.

У крыс, получавших рацион с содержанием витаминов в 5 раз меньше, чем в контрольной группе, был установлен глубокий дефицит водо- и жирорастворимых витаминов [1]. Состояние полигиповитаминоза у крыс 2-й группы приводило к существенному и статистически достоверному (р<0,05) снижению в печени активности МРОД (78% от контрольного уровня), 4-нитрофенолгидроксилазы (74% от контроля), гемоксигеназы-1 (83% от контроля) и хинонредуктазы (60% от контрольного уровня) (табл. 2 и 3). Активность UDP-глюкуронозилтрансферазы независимо от степени витаминной недостаточности оставалась выше контрольного уровня (на 22%). Активность остальных изученных ферментов - ЭРОД, ПРОД, 6β-ТГ, глутатионтрансферазы - не отличалась от таковой в контрольной группе.

Таблица 2. Активность цитохромов Р450 в печени крыс, получавших рационы с разным содержанием витаминов (M±m)

Таблица 3. Активность ФМК II фазы в печени крыс, получавших рационы с разным содержанием витаминов (M±m)

При определении экспрессии генов отдельных изоформ цитохрома Р450 было установлено, что в печени крыс с умеренным дефицитом витаминов (1-я опытная группа) имеются лишь тенденция к увеличению экспрессии мРНК CYP1A1 и несущественное уменьшение экспрессии мРНК CYP1A2, CYP3A1 и AhR (см. рисунок). При глубоком дефиците витаминов (2-я опытная группа) экспрессия мРНК CYP1A1 и мРНК AhR в печени крыс не отличалась от контрольного уровня, в то время как экспрессия мРНК CYP1A2 и CYP3A1 была понижена, соответственно, до 62 и 79% от уровня в контроле.

Не обнаружено существенного влияния разной обеспеченности рационов витаминами на устойчивость микросом, выделенных из печени крыс, к NADPH-Fe2+-индуцированному ПОЛ. Скорость ПОЛ, оцениваемая по образованию МДА, составила для крыс контрольной, 1-й и 2-й опытных групп соответственно 10,3±0,9; 11,9±0,8 и 8,1±0,7 нмоль/мг белка за 10 мин.

Определение АОА как одного из интегральных показателей антиоксидантного статуса выявило небольшое, статистически достоверное снижение у крыс 1-й и 2-й опытных групп АОА плазмы крови соответственно на 10 и 12% и АОА фракции цитозоля печени - на 8 и 7%, соответственно (табл. 4).

Таким образом, проведенные исследования показали, что в разной степени пониженное содержание витаминов в рационе крыс и развитие разной глубины полигиповитаминоза оказывают различное по характеру влияние на активность ФМК. При умеренном полигиповитаминозе активность изученных ФМК не отличалась от контрольного уровня (ПРОД, глутатионтрансфераза, гемоксигеназа-1) или умеренно возрастала (МРОД, 4-нитрофенолгидрокслаза, UDP-глюкуронозилтрансфераза, хинонредуктаза). Результаты изучения экспрессии мРНК CYP1A1 и CYP1A2 свидетельствуют о том, что возрастание их активности не связано с изменением экспрессии их генов или гена AhR - главного и, может быть, единственного регулятора активности CYP1A1 и CYP1A2 на уровне транскрипции.

Относительный уровень мРНК CYP1A1 (а), CYP1A2 (б), CYP3A1 (в) и AhR (г) в печени крыс, получавших рационы с разным содержанием витаминов

К - контрольная группа.

Таблица 4. Антиоксидантная активность плазмы крови и печени крыс, получавших рационы с разным содержанием витаминов (M±m)

Более глубокая форма полигиповитаминоза у крыс, в отличие от умеренной, сопровождалась снижением активности МРОД (CYP1A2), 4-нитрофенолгидроксилазы (CYP2E1), гемоксигеназы-1 и хинонредуктазы. При этом снижение активности МРОД (78% от контрольного уровня) коррелировало с подавлением экспрессии мРНК CYP1A2 (62% от контроля), но не зависело от изменения экспрессии гена AhR (96% от контроля). Обращает на себя внимание снижение экспрессии CYP3A1 (79% от контроля), хотя не обнаружено изменений его 6β-ТГ-активности. Важно отметить, что CYP3A4 (гомолог CYP3A1 у крыс) и CYP1A2 входят в число основных цитохромов Р450, осуществляющих метаболизм лекарственных средств, и изменение их активности может приводить к изменению фармакокинетики и конечного эффекта лекарственных средств [17].

Как уже отмечалось, в экспериментах in vitro витамин Е индуцировал экспрессию гена транскрипционного фактора Nrf2 и генов регулируемых им ферментов [11, 14]. Это позволяет предположить, что уменьшение почти вдвое содержания витамина Е в печени крыс с глубоким полигиповитаминозом [1] может быть одной из причин снижения у них Nrf2-регулируемой активности гемоксигеназы-1 и хинонредуктазы.

В то же время, несмотря на значительное снижение уровня витамина Е, являющегося главным липофильным антиоксидантом клетки, от которого в значительной мере зависят стабильность и чувствительность мембран к ПОЛ, нами не обнаружено снижения резистентности микросомальных мембран к индуцированному ПОЛ. Кроме того, независимо от резкого уменьшения содержания витаминов-антиоксидантов в печени крыс 2-й опытной группы [1], у них не наблюдали выраженных проявлений окислительного стресса. Это позволяет предположить, что обнаруженное у крыс с глубоким полигиповитаминозом снижение активности ФМК (большинство из которых - мембраносвязанные ферменты) не является результатом изменения свойств микросомальных мембран или усиления процессов ПОЛ, а связано с нарушением регуляции синтеза ферментов.

В заключение следует отметить, что впервые получены экспериментальные данные о влиянии поливитаминной недостаточности на активность ФМК, показавшие, что непродолжительный, но глубокий полигиповитаминоз у крыс приводит к снижению активности и(или) экспрессии генов отдельных ФМК, играющих важную роль в процессах детоксикации, метаболизма лекарственных средств и антиоксидантной защиты.

Литература

1. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Бекетова Н.А. и др. // Вопр. питания. - 2011. - № 4. - С. 56-61.

2. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Спиричев В.Б. // Вопр. питания. - 2010. - № 3. - С. 68-72.

3. Кравченко Л.В., Морозов С.В., Тутельян В.А. // Бюл. экспер. биол. - 2003. - № 12. - С. 648-652.

4. Сушко Л.И., Лукиенко П.И. // Фармакол. и токсикол. - 1981. - № 1. - С. 102-104.

5. Benson A., Hunkeler M. J., Talalay P. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 1980. - Vol. 77. - P. 5216-5220.

6. Benzie I.F.F., Strain J.J. // Anal. Biochem. - 1996. - Vol. 239. - P. 7 0 - 7 6 .

7. Burchell B., Weatherill P. // Methods Enzymol. - 1981. - Vol. 77. - P. 169-177.

8. Burke M.D., Mayer R.T. // Chem. Biol. Interact. - 1983. - Vol. 45. - Р. 243-258.

9. Chen H.W., Lii C.K., Sung W.C. et al. // Nutr. Cancer. - 1998. - Vol. 31. - P. 178-183.

10. Chen S., Wang K., Wan Y.J. // Biochem. Pharmacol. - 2010. - Vol. 79. - P. 270-276.

11. Feng Z., Liu Z., Li X. et al. // J. Nutr. Biochem. - 2010. - Vol. 21. - P. 1222-1231.

12. Gupta P.H., Mehta S., Mehta S.K. // Biochem. Int. - 1989. - Vol. 19. - P. 123-133.

13. Habig W.H., Pabst M.J., Jakoby W.B. // J. Biol. Chem. - 1974. - Vol. 249. - P. 7140-7150.

14. Hsieh T.C., Elangovan S., Wu J.M. // Anticancer Res. - 2010. - Vol. 30. - P. 4169-4176.

15. Martini R., Butler A.M., Jiang X.M., Murray M. // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1995. - Vol. 273. - P. 427-434.

16. McNally S.J., Ross J.A., Garden O.J., Wigmore S.J. // Anal. Biochem. - 2004. - Vol. 332. - P. 398-400.

17. Michalets E.L. // Pharmacotherapy. - 1998. - Vol. 18. - P. 8 4 -112 .

18. Mustacich D.J., Gohil K., Bruno R.S. et al. // J. Nutr. Biochem. - 2009. - Vol. 20. - P. 469-476.

19. Mustacich D.J., Leonard S.W., Devereaux M.W. et al. // Free Radic. Biol. Med. - 2006. - Vol. 41. - P. 1069-1078.

20. Nakajima M., Nakamura S., Tokudome S. et al. // Drug Metab. Dispos. - 1999. - Vol. 27. - Р. 1381-1391.

21. Rьhl R., Sczech R., Landes N. et al. // Eur. J. Nutr. - 2004. - Vol. 43. - P. 336-343.

22. Wade A.E., Evans J.S., Holmes D., Baker M.T. // Drug Nutr. Interact. - 1983. - Vol. 2. - P. 117-130.

23. Wang K., Chen S., Xie W., Wan Y.J. // Biochem. Pharmacol. - 2008. - Vol. 75. - P. 2204-2213.

24. Yoo J.S., Park H.S., Ning S.M. et al. // Biochem. Pharmacol. - 1990. - Vol. 39. - P. 519-525.