Influence of anatase titanium dioxide nanoparticles on protein expression profiles in rat liver microsomes

AbstractThere was studied an influence of intragastric administration of titanium dioxide (anatase form) nanoparticles (NP) on protein expression profiles in rat’s liver microsomes by methods of proteomics. Animals received water suspension of NP in doses from 0,1 to 10 mg per kg body weight intragastirically daily during 28 days. Microsomes were isolated from liver by means of preparative ultracentrifugation. Proteins composition was studied by 2D-electrophoresis in acrylamide gel. Protein spots were identified by MALDI-TOF analysis. The results demonstrated appearance of 53 new protein spots and disappearance of 19 spots in animals subjected to NP irrespective of their dose. In addition 25 new spots appeared and 3 disappeared in higher doses of NP when compared to low dose group and control animals. Mass-spectrum analysis showed presence of few polypeptides registered in international database among proteins expressed under influence of NP. One of this dominant expressed proteins corresponded to enzyme glutathione transpherase Mu 2 isoform (M=41,55 kD, pI=8,0). The conclusion was made of well advances of proteomic analysis in artificial NP influences on biosynthetic processes estimation.

Keywords:titanium dioxide, nanoparticles, rats, toxicity, two-dimensional electrophoresis

Вопр. питания. - 2012. - № 2. - С. 18-22.

При производстве пищевых продуктов могут использоваться вещества, содержащие наночастицы (НЧ) различных химических элементов, в том числе диоксид титана (TiО2). Известно, что обычный диоксид титана с частичами микронного размера длительное время применяется в качестве разрешенной пищевой добавки Е171 (красителя) [11], а также, кроме изготовления упаковочного материала, он используется при производстве косметических средств и медицинских препаратов. Вопрос о безопасности применения для этих целей наноразмерной дисперсии TiO2 изучен недостаточно.

Согласно данным ряда работ, НЧ TiO2 оказывают повреждающее воздействие в культуре как малигнизированных [7], так и неизмененных [9] клеток. Механизм цитотоксического действия НЧ TiO2 связывают с процессами образования реактивных форм кислорода, оказывающих повреждающее действие на ДНК и запускающих процессы митохондриального апоптоза [7]. Токсичность НЧ TiO2 для лабораторных животных выявлена при поступлении этого вещества в организм через респираторный [5] и желудочно-кишечный [2, 4] тракт. Ввиду высокой адсорбционной способности данного вида НЧ они могут усиливать проникновение в клетки традиционных химических токсикантов, таких как ДДТ [10].

При оценке возможных токсических воздействий НЧ на организм большое значение имеют подходы, позволяющие установить эффект в отношении экспрессии генов и синтеза белков. В частности, это метод двумерного (2D) электрофореза, который используется как один из компонентов системы протеомного анализа. Так, в работе [6], выполненной на лейкемических клетках человека, с использованием этого метода было показано изменение до 37 белковых фракций (пятен) под действием препарата многостенных углеродных нанотрубок. Идентификация белков методом массспектрометрии показала наличие белков теплового шока b1, нейтральной α-глюкозидазы АВ и белка системы репарации ДНК Msh2. При воздействии НЧ диоксида кремния на клетки НаСаТ выявлено до 16 белков, изменяющихся в протеомном профиле, включая стресс-ассоциированные белки, ферменты энергетического обмена, факторы апоптоза и продукты экспрессии онкогенов [13]. В то же время не выявлено существенных изменений в протеоме клеток под воздействием НЧ гидроксилапатита [12].

Задачей настоящего исследования стало изучение возможных изменений протеомного профиля микросом гепатоцитов крыс, получающих внутрижелудочно НЧ TiO2 в кристаллической модификации анатазы (далее - анатаза).

Материал и методы

В работе использовали препарат НЧ анатазы производства "Sigma-Aldrich" (Германия-США). Согласно данным исследований, проведенных методом электронной микроскопии на кафедре биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, препарат состоял из частично агрегированных частиц округлой формы со средним размером 20-30 нм. Образец представлял собой легкий порошок белого цвета, негигроскопичный, склонный к пылеобразованию, при смешении с водой дающий стойкую суспензию молочнобелого цвета.

В основу дизайна эксперимента положены МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов" [3].

Исследование проведено на 24 белых крысах самцах Вистар с исходной массой тела 108±2 г (M±m), полученных из питомника РАМН "Столбовая".

Мастер-гель микросомальных белков печени крыс

Отмечено положение пятна изоформы Mu 2 глутатион-Sтрансферазы (молекулярная масса 41,55 кД; pI=8,0), появляющейся на электрофореграммах при дозе наночастиц диоксида титана 0,1 мг/кг массы тела и более.

Крыс содержали в клетках по 3 животных и кормили на протяжении всего эксперимента сбалансированным полусинтетическим рационом [3]. Животные были разделены на 4 группы по 6 крыс. Крысам 1-й (контрольной) группы внутрижелудочно вводили деионизированную воду.

Животным 2-й, 3-й и 4-й опытных групп вводили НЧ анатазы в виде суспензии в дистиллированной воде с концентрацией соответственно 0,1; 1,0 и 10 мг/кг массы тела в день. За 12 ч до умерщвления (путем декапитации под мягким эфирным наркозом) у животных отбирали весь корм. Умерщвление животных осуществляли на 29-й день эксперимента. На вскрытии брали печень и подвергали ее гомогенизации для получения микросомальной фракции. Гомогенизацию печени проводили в 0,1 М ТрисНСl в буфере рН 7,4, охлажденном до 0 - +2 °С при соотношении массы и объема 1:4. Полученные гомогенаты печени фракционировали методом дифференциального центрифугирования c получением микросомальной и цитозольной фракций.

Белковый состав микросомальной фракции анализировали с помощью двумерного электрофореза. 1-е направление (изоэлектрофокусирование в амфолинах) осуществляли в стеклянных трубочках с 4% полиакриламидным гелем (ПААГ) в градиенте рН 3-10 до достижения потенциала 900 В. Во 2-м направлении разделение осуществляли в 12% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия [1]. Электрофорез проводили при последовательном токе 20 и 40 мА на одно стекло; окрашивали серебром с использованием наборов "Bio-Rad". Изображения протеомных карт получали с помощью денситометра GS-800.

Обработку изображений гелей проводили по программе PDQuest. Каждое пятно на изображении геля соответствовало отдельному белку с характерной для него молекулярной массой и изоэлектрической точкой. Все изображения гелей сравнивали между собой наложением. По результатам сравнения 24 электрофореграмм микросом печени крыс составлен мастер-гель, состоящий из 360 белковых пятен, из которых 9 пятен представляли собой стандарты молекулярных масс белков (см. рисунок). На мастер-гель наносили только те белковые пятна, которые выявлялись как минимум на 3 электрофореграммах, принадлежащих к одной из групп (с 1-й по 4-й).

Идентификацию пятен белков проводили с помощью масс-спектрометрии трипсиновых гидролизатов, экстрагированных из гелей, белков на времяпролетном масс-спектрометре с использованием технологии MALDI (лазерная десорбция-ионизация на матрице) [8]. Для анализа выбирали наиболее яркие белковые пятна, которые появлялись или исчезали при воздействии НЧ. Идентификацию белков выполняли с помощью программного обеспечения MASCOT (www.matrixscience.com); спектры анализируемых белков сравнивали с NCBInrбазой данных (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Таблица 1. Характеристики протеома микросом печени крыс 1-4-й групп

Результаты

В результате исследования установлено следующее: у животных 1-й группы в микросомальной фракции печени обнаружено 181 белковое пятно, 2-й группы - 210, 3-й группы - 238, 4-й - 236 белковых пятен (табл. 1). У животных всех экспериментальных групп (2-4-я) в микросомах печени суммарно выявлено 111 белковых пятен, которых не было в контрольной группе. При этом 53 пятна были характерными для всех экспериментальных групп животных независимо от дозы введенных в организм НЧ TiO2. У животных 2-й группы дополнительно определено 15 белковых пятен, выявляемых только у животных этой группы, в 3-й - 26, в 4-й - 17 белковых пятен. Указанные белки имели молекулярную массу в диапазоне от 16,34 до 111,36 кДа.

В ходе исследования протеомного профиля микросом печени крыс не только появлялись новые белковые пятна, но и исчезали присутствующие в микросомах печени животных контрольной группы. Так, введение НЧ TiO2 сопровождалось суммарным исчезновением 23 белковых пятен, которые были идентифицированы в контроле. Из них 19 белковых пятен не выявляются при введении животным всех исследуемых доз TiO2; 2 белковых пятна не выявлялись только у животных 2-й группы и еще 2 - у животных 4-й группы. Указанные белки имели молекулярную массу в диапазоне от 14,0 до 132,77 кДа.

Таким образом, у животных всех экспериментальных групп независимо от используемых доз НЧ TiO2 были выявлены 53 новых белковых пятна и исчезли 19 (по сравнению с контрольной группой). При введении НЧ TiO2 в высоких дозах у животных 3-й и 4-й групп дополнительно появились 25 белковых пятен, отсутствовавшие в контроле у животных 2-й группы, а также исчезли 3 белковых пятна, присутствующие в микросомах печени животных 1-й и 2-й групп. Согласно полученным данным (табл. 2), при введении НЧ TiO2 наблюдается экспрессия большого числа новых белков, отсутствовавших в значимых количествах в микросомах гепатоцитов животных, которым не вводили НЧ TiO2.

Масс-спектрометрическая идентификация белков, экспрессируемых под действием НЧ анатазы в микросомах гепатоцитов, позволила выявить ряд белков, присутствующих в базе данных, однако их биологическую функцию на основе данных, полученных нами в настоящем эксперименте, установить невозможно. Исключением был один доминантный белковый пик, экспрессируемый под воздействием НЧ в микросомах печени животных 2-4-й групп. Было установлено, что он представлен изоформой Мu 2 фермента глутатион-S-трансферазы (см. рисунок), причем молекулярная масса этого белка составила 41,55 кД, изоэлектрическая точка рI=8,0.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что пероральное введение крысам на протяжении 28 дней НЧ TiO2 в концентрации от 0,1 до 10,0 мг/кг массы тела в день влияет на экспрессию белков микросом печени крыс, что выражается в появлении большого числа новых белков по сравнению с контролем. Это особенно выражено при введении НЧ TiO2 в высоких концентрациях. Полученные данные указывают на перспективность использования метода двумерного электрофореза в сочетании с масс-спектрометрией для оценки эффектов, в том числе токсикологических, оказываемых искусственными НЧ на организм. При этом необходимо идентифицировать вновь экспрессируемые функционально значимые белки, биосинтез которых является мишенью воздействия НЧ при их поступлении в организм.

Настоящая работа выполнена за счет средств Федерального бюджета, по государственному контракту с Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2011 гг.".

Таблица 2. Характеристика протеома микросом печени крыс 1-4-й групп

Литература

1. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). - М.: Наука, 1981. - 288 с.

2. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

3. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. Методические указания МУ 1.2.2520-09. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 36 с.

4. Шевелева С.А., Кузнецова Г.Г., Батищева С.Ю. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 5. - С. 29-34.

5. Chen H.W., Su S.F., Chien C.T. et al. // FASEB J. - 2006. - Vol. 20, N 13. - P. 2393-2395.

6. Haniu H., Matsuda Y., Takeuchi K. et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2010. - Vol. 242, N 3. - P. 256-262.

7. Jin C., Tang Y., Yang F.G. et al. // Biol. Trace Elem. Res. - 2011. - Vol. 141, N 1-3. - P. 3-15.

8. Karpova M.A., Moshkovskii S.A., Toropygin I.Y., Archakov A.I. // J. Proteomics. - 2010. - Vol. 73, N 3. - P. 537-551.

9. Koeneman B.A., Zhang Y., Westerhoff P. // Cell Biol. Toxicol. - 2010. - Vol. 26, N 3. - P. 225-238.

10. Shi Y., Zhang J.H., Jiang M. et al. // Environ. Mol. Mutagen. - 2010. - Vol. 51, N 3. - P. 192-204.

11. Titanium dioxide. FAO JECFA Monographs 10. - Rome: FAO JECFA, 2010. - 6 p. (http://www.fao.org/ag/agn/jecfa-additives/specs/monograph7/additive-466-m7.pdf).

12. Xu J.L., Khor K.A., Sui J.J. et al. Protein expression profiles in osteoblasts in response to differentially shaped hydroxyapatite nanoparticles // Biomaterials. - 2009. - Vol. 30, N 29. - P. 5385-5391.

13. Yang X., Liu J., He H. et al. // Part Fibre Toxicol. - 2010. - Vol. 7, N 1. - P. 1-12.